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缺氧和酸中毒免疫抑制因素及治疗靶点

由于肿瘤微环境中血管生成和细胞生长的不平衡性，会出现包括缺氧和酸中毒等多种代谢相关应激反应。这些应激反应具有免疫抑制作用，可以帮助肿瘤逃避机体免疫监视。年，SultanDamgaci教授在《Immunology》杂志上发表了题为《HypoxiaandAcidosis:ImmuneSuppressorsandTherapeuticTargets》的综述，探讨缺氧和酸中毒对肿瘤免疫的抑制作用和相应治疗靶点，现介绍如下。

肿瘤组织内不仅包含肿瘤细胞，还包括基质细胞、血管生成细胞、肿瘤相关成纤维细胞和大量浸润的炎症细胞（图1）。肿瘤的特征如增殖、抵抗细胞死亡、诱导血管生成、侵袭和转移、逃避生长抑制和逃避免疫监视及攻击等都与机体的免疫功能密切相关。肿瘤细胞可通过多种机制抑制T细胞的活化：通过调节性T细胞（Treg细胞）分泌抑制性细胞因子如IL-10和TGF-β；或通过自然杀伤（NK）细胞和CD4+T细胞分泌颗粒酶以达到细胞溶解；或者通过影响效应T细胞（Teff）的代谢，或树突状细胞（DC）通过CTLA-4靶向作用于T细胞。CTLA-4和PD-1在肿瘤免疫治疗中作为检查点具有重要作用，细胞毒性T细胞相关蛋白-4（CTLA-4,CytotoxicTlymphocyteassociateprotein-4）是T细胞表面表达的一类共刺激分子，对免疫反应有负性调节作用。与CD28的功能类似，在T细胞激活过程中，CTLA-4能够与APC表面的CD80/CD86特异性结合来激活下游信号。程序性死亡受体1（PD-1,programmeddeath1）为CD28超家族成员，其配体是PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）。PD-L1表达上调可以抑制T细胞抗肿瘤反应。巨噬细胞分为抗炎型（M1）和促炎型（M2）两类，经典激活的M1巨噬细胞表达CD80/CD86分子并可激活T细胞。此外，M1巨噬细胞可以杀伤致病细菌和杀死肿瘤细胞。M2巨噬细胞表达免疫抑制配体。在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞打破正常的肿瘤特异性免疫应答机制以逃避机体的免疫监视，如通过巨噬细胞亚群比例的改变，肿瘤相关巨噬细胞（TAM,tumor-associatedmacrophage）的形成和肿瘤细胞上的免疫抑制配体（如B7H4）的表达上调等。髓源性抑制细胞（MDSCs,Myeloid-derivedsuppressorcells）也具有免疫抑制功能，对T细胞和NK细胞的功能具有负性抑制作用。下面主要介绍肿瘤组织中缺氧和酸中毒对抗肿瘤免疫反应的抑制作用。

图1.肿瘤微环境中的细胞构成

缺氧对免疫功能的影响

结直肠癌可通过血液、淋巴或体腔种植转移，肝脏、腹膜、肺以及骨是最常见的是转移部位。转移过程既受肿瘤细胞本身的生物学特性的影响，也与机体的反应密切相关。目前已有证据表明手术本身及相关并发症，以及围术期相关因素如麻醉及镇痛，可通过直接作用于肿瘤细胞或作用于包括免疫系统在内的肿瘤微环境来影响肿瘤的转移。手术在切除病灶的同时也可以促进肿瘤播散，并促进术前已经发生的微小转移的进展等。

在围手术期通过减轻手术创伤减少术后肿瘤转移复发是目前研究的热点之一，但对于肿瘤手术促进术后转移发生的人体研究目前难以实行，因为外科手术导致的应激反应十分复杂，难以单独衡量其影响的大小，目前的数据主要来源于动物模型或从临床数据中推测而来。围术期许多因素可导致转移的发生，包括麻醉药物的使用、术后镇痛以及输血等。手术创伤伴随的生理学改变如低体温、禁食、疼痛以及心理应激亦可影响手术应激程度。其他术后并发症如感染不仅可加剧应激反应，还可导致常规在结直肠癌手术后6-8周进行的化疗中断。手术应激还可通过影细胞毒性药物的药代动力及跨膜运输来影响转移。

手术创伤的促转移作用

肿瘤组织内缺氧是由于肿瘤细胞增殖导致需氧增加以及肿瘤血管分布不均导致局部血液供应不足。虽然肿瘤可以通过血管内皮生长因子（VEGF）信号促进血管形成，但未受调控的VEGF实际上会导致血管的过度增殖，毛细血管网分布不平衡从而导致组织灌注减少。缺氧对参与免疫反应的细胞均有显著影响。

1.1缺氧对淋巴细胞的影响：

淋巴细胞主要分为T细胞，B细胞和NK细胞。研究发现，与正常氧浓度相比，低氧显著抑制淋巴细胞增殖。HIF1-α能够调节Treg细胞与Th17细胞的分化平衡，促使肿瘤细胞和MDSC上的PD-L1表达从而抑制Teff细胞。缺氧能够增加Treg细胞的主要调节因子FOXP3的转录因子水平。缺氧还促进TGF-β和CCL28的产生，两者都能上调Treg细胞，抑制Teff细胞反应以及促进血管生成和肿瘤耐受。此外，缺氧使CD4+细胞倾向于向Th2表型分化，分泌的IL-4有促进巨噬细胞向M2型分化的作用。已有研究表明，由cAMP腺苷受体A2AR促进的胞外腺苷的聚集能够抑制T细胞的抗肿瘤活性。

HIF1-α上调的金属蛋白酶ADAM10和下调的MHCI类链相关基因A（MICA）对细胞抗NK细胞杀伤有重要作用。肿瘤细胞MICA的表达水平决定着肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性，NK细胞上的NK2D和MICA之间的相互作用在NK细胞对肿瘤细胞的应答方面起着关键作用。在缺氧状态下，TGF-β的上调会降低NK细胞上的NKG2D受体。此外，缺氧诱导的自噬导致NK细胞的颗粒酶B降解使得肿瘤细胞逃逸NK细胞的杀伤作用。缺氧对降低NK活性的影响也可以是间接的。在黑色素瘤细胞中，缺氧状态下以HIF1-α依赖的方式增加间隙连接蛋白Connexin43的表达，Connexin43使得细胞对NK细胞介导的杀伤作用敏感性降低。

1.2缺氧对髓系细胞的影响：

巨噬细胞是肿瘤微环境中最丰富的髓系细胞之一。巨噬细胞的主要作用是吞噬和消化受损组织和外来物质，包括微生物，细胞外基质和肿瘤细胞。然而，受到肿瘤缺氧环境的影响，TAMs可通过诱导血管生成和基质重塑促进肿瘤的恶性进展。缺氧使得VEGF、成纤维细胞生长因子和基质金属蛋白酶7和9表达增加，导致TAMs在缺氧区域浸润增加，从而促进肿瘤进展。体内实验已经表明在炎症微环境中，HIF1-α对于调节髓系细胞的糖酵解代谢，生长和功能而言是必需的。TAMs和MDSC通过神经毡蛋白及其受体脑信号蛋白3A结合进入缺氧区。在进入缺氧区后，HIF1-α下调脑信号蛋白3A，导致这些细胞在缺氧区积累。腺癌模型中的研究证实，TAM的M1表型在正常氧浓度状态下占优势，而TAM的M2表型在低氧环境中占主导地位。此外也检测了在不同类型的TAM状态下HIF活性。HIF1-α在M1极化期间稳定，HIF2-α在M2极化期间稳定。为何出现这样的差异目前仍需要进一步研究，但是已经发现HIF2-α是精氨酸酶基因表达的重要调节因子，而精氨酸酶是M2极化的重要标志。缺氧诱导单核巨噬细胞表达血管生成素-2受体（Tie2+）的TAMs，具有促进血管形成的作用。目前已知TAMs表达的HIF1-α也能够抑制T细胞应答并促进MDSC上的PD-L1表达。

1.3缺氧对中性粒细胞的影响：

中性粒细胞是人体内最主要的固有免疫细胞之一，肿瘤微环境中的中性粒细胞对肿瘤的发展起到促进的作用，浸润性中性粒细胞产生的细胞因子和趋化因子能影响肿瘤微环境中炎症细胞的招募和激活,为肿瘤的发展提供良好的免疫抑制微环境，调控肿瘤的生长、转移和血管生成。肿瘤的高侵袭率与缺氧诱导的中性粒细胞升高之间存在相关性。缺氧通过HIF1-α介导促进中性粒细胞的存活；而激活脯氨酰羟化酶，PHD-2和PHD-3能够促进HIF1-α的降解。此外缺氧也会影响中性粒细胞趋化迁移。

1.4缺氧对树突状细胞的影响：

树突状细胞(DC，Dendriticcell)是抗原呈递细胞，在连接固有免疫和获得性免疫方面发挥重要作用。目前研究缺氧对DC影响的研究较少。缺氧和HIF1-α能够调节DC成熟，活化和抗原呈递功能，缺氧通过DC调节共刺激分子CD80和CD86的表达。HIF1-α也阻碍髓样前体细胞分化为浆细胞样DC。

表1.缺氧对免疫细胞的影响

酸中毒对免疫功能的影响

尽管酸中毒导致的组织低pH值在实体肿瘤中普遍存在，但是目前研究其对免疫系统影响结果较少。肿瘤酸中毒是由糖酵解代谢和灌注不足导致。有氧糖酵解是肿瘤的特征之一，即使在氧气供应充足的条件下，肿瘤细胞仍偏好于选择采用有氧糖酵解方式为自身供能，而非选择ATP生成效率更高的氧化磷酸化。有氧糖酵解导致细胞外环境的酸化，此外乳酸的释放也有助于肿瘤细胞逃避免疫监视。乳酸是影响肿瘤酸度，局部侵袭和基质重塑的启动子。肿瘤微环境的酸性程度与肿瘤发生有相关性，包括在肿瘤发生的最初阶段肿瘤细胞的存活，逃避细胞凋亡和药物抵抗。

2.1酸中毒对淋巴细胞的影响：

肿瘤细胞和免疫细胞高度依赖于糖酵解途径进行增殖、存活和保持活性。即使在有氧条件下，肿瘤细胞也依赖于糖酵解，这使得肿瘤细胞能够比不利用糖酵解的细胞更快速地适应变化的环境。此外，糖酵解可以显着降低葡萄糖的可用性，在没有葡萄糖的情况下，肿瘤细胞可以进入静止期，但活化的T细胞则不能存活。肿瘤的酸性微环境似乎对CD4+Treg细胞影响不大，可能是因为它们主要依靠脂肪酸氧化供能。与CD4+细胞相反，在人和小鼠肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞中发现酸性微环境可以诱导细胞处于失能状态，细胞活性降低，细胞因子分泌下降，STAT5/ERK信号的激活减弱，从而下调IL-2Ra（CD25）和TCR的表达。体外研究表明，外环境的pH值提高可以逆转T细胞失能状态，而长期暴露于低pH值环境可导致细胞永久性损伤或诱导T细胞凋亡。此外，肿瘤酸性环境通过抑制Th1淋巴细胞的成熟和功能来促进肿瘤进展，同时通过失活IFN-γ和抑制肿瘤坏死因子TNF-α来刺激能够促进肿瘤进展的Th2淋巴细胞。有研究表明，通过口服缓冲液中和体内肿瘤酸度，可以增加免疫检查点抑制剂和过继性T细胞治疗的功效。

2.2酸中毒对髓系细胞的影响：

酸中毒对巨噬细胞作用的研究较少。一些研究侧重于对肿瘤血管生成的影响，并且表明在乳腺癌中，低pH和高乳酸浓度可以刺激TAMs激活和转化成促血管生成的表型。有研究发现肿瘤细胞产生的乳酸通过诱导VEGF和类似M2的极化而影响TAMs的信号传导，并引起巨噬细胞中精氨酸酶1的表达以抑制T细胞增殖和活化。

2.3酸中毒对树突状细胞的影响：

研究酸中毒对DC细胞的作用发现，细胞外酸度能够改善来源于鼠骨髓的DC的抗原递呈能力。在这项研究中，乳酸单独或与肿瘤来源的巨噬细胞集落刺激因子及IL-6共同作用，都可以显著改变DC的抗原递呈能力和功能活性。

表2.乳酸和酸中毒对免疫细胞的影响

针对缺氧和酸中毒改进免疫治疗

免疫治疗的主要类型包括免疫检查点抑制剂、肿瘤疫苗和过继性T细胞治疗。虽然目前取得了重大进展，但长期有效率仍然较低。例如，抗PD-1或PD-L1抗体对黑色素瘤的客观反应率为18％至27％，抗CTLA-4抗体为11％。尽管PD-1和CTLA-4抗体的联合使用与单独使用相比增加了20％至40％，但仍有60％的患者无反应。所以如何进一步改善治疗效果是需要深入研究的问题。结合上述缺氧和酸中毒对免疫功能的影响，调控肿瘤的微环境可能是可以改善部分患者免疫治疗结果的手段之一。

3.1靶向低氧联合免疫治疗：

缺氧可以影响免疫检查点受体及其配体的表达。处于缺氧状态的细胞通过HIF1-α选择性地上调MDSCs上的PD-L1，此外缺氧还显着增加巨噬细胞，树突状细胞和肿瘤细胞上PD-L1的表达。在乳腺癌小鼠模型中，使用HIF1-α抑制剂联合基于DC的免疫疗法治疗后显示肿瘤消退，并且存活率显著改善。另外，可以通过减少免疫抑制细胞的数量和功能，增加效应T细胞功效来增强免疫治疗效果。肿瘤细胞通过产生VEGF，促血管生成素-2，IL-8和其他因子促进血管生成以适应缺氧。由于功能障碍的血管导致组织缺氧和肿瘤抵抗，所以血管正常化能大幅减少肿瘤微环境中的缺氧范围，如通过靶向作用VEGF/VEGFR使血管正常化，以促进CTL进入肿瘤区域，还可以促进巨噬细胞极化并刺激向M1表型分化，诱导Th1并促进IFN-γ和IL-12的分泌，从而使得CTL浸润，Treg细胞减少。Evofosfamide（TH-）是一种选择性低氧激活的前体药物，靶向作用于实体瘤的缺氧区域，其在动物前列腺癌模型中发现可以改善免疫检查点（CTLA-4,PD-1）阻断疗效。

3.2靶向酸中毒联合免疫治疗：

在动物肿瘤模型中发现，使用缓冲液中和肿瘤酸中毒联合免疫疗法可以改善治疗效果。在B16黑素瘤和Panc02胰腺癌中，通过自由口服碳酸氢盐缓冲液（mM）用于中和肿瘤酸度，并且与抗CTLA-4、抗PD-1或过继T细胞疗法联合使用可带来持久应答。然而，缓冲液疗法在临床上并不容易实施，三项临床试验（NCT-，NCT-和NCT-）均由于患者的不良依从性和不良胃肠道事件而宣告失败。另一种提高肿瘤组织pH的方法是使用脲酶。脲酶是尿素降解酶，可将尿素转化为氨，产生的氨使得局部pH值升高。此外，可以通过影响代谢或离子转运间接地改变肿瘤酸度。例如，碳酸酐酶IX（CA-IX）作为在细胞外表面可逆地将CO2水合成碳酸氢盐和质子的催化剂，可以控制细胞内和细胞外酸碱平衡，调节细胞及其周围的环境的pH值。选择性抑制CA-IX的小分子抑制剂成为一个潜在的抗癌靶点。

总结

目前，肿瘤治疗方式主要有手术、化疗、放疗、免疫治疗等，肿瘤的免疫治疗已经被证实能够在大量患者中产生持久效应。缺氧和肿瘤组织的酸性环境都对免疫系统有直接和间接的抑制作用，已有研究表明缺氧和低pH值可导致免疫治疗的抵抗。所以深入探究缺氧和酸性pH对免疫系统的影响，有助于提高肿瘤免疫治疗的疗效，探索新的治疗肿瘤的思路和方法。

（编译祁洁；审阅缪长虹）

原始文献：

DamgaciS,Ibrahim-HashimA,Enriquez-NavasPM,Pilon-ThomasS,GuvenisA,GilliesRJ.Hypoxiaandacidosis:immunesuppressorsandtherapeutictargets.Immunology.Feb27.doi:10./imm..[Epubaheadofprint]

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